Adi bir PCR sistemi ilə real vaxt PCR sistemi arasındakı fərq nədir?


cavab 1:

Bir sözlə, prinsip eynidır: iki astarınız var (FW və RV). Onlar müəyyən bir hədəfə qarşı və ya bir neçə hədəfə bağlanmaya qarşı hazırlanmışdır, lakin ortaq olaraq qorunan bir ardıcıllığa malikdirlər.

Real vaxt rejimində PCR-də astarların istifadəsi, cüt telli DNT-də (SYBR Yaşıl kimi intercalation agenti kimi də tanınır) və ya flüoroxrom və söndürücü daşıyan zondlarla birləşən flüoresan boya ilə birləşdirilir. Hər iki yanaşma (bunları ətraflı şəkildə bilməlisinizsə, sizə izah edəcəyəm, amma əsas suala cavab verəcəyəm) sizə real vaxt rejimində amplifikasiya mərhələsində hədəf DNT molekulunun amplifikasiyasını izləmək və müstəntiqə kəmiyyət təhlili vermək imkanı verir .

Niyə faydalıdır?

PCR nə edir? Sıxlaşır. Hər təkan hadisəsi təkan dövrü adlanır. Adətən bir reaksiya üçün gücləndirici dairələr (25 ilə 28 arasında) 30 cicles altında saxlanılır. Niyə bu? Çünki PCR bir şeyin olub olmadığını və ya bu vəziyyətdə bir nəzarətlə müqayisədə daha çox və ya daha az bir şeyin olub olmadığını görmək üçün istifadə olunur. Möhkəmləndirmə addımları çox olarsa, bir şeyin həqiqətən olub olmadığını başa düşə bilmirsən və ya elə bir siqnal görürsən ki, onu tez-tez gücləndirirsən, elə bil bir anda bir şey var (ağla, bu mənəm) "kəmiyyət verməyin", çünki standart PCR təbii olaraq bunu mümkünsüz edir).

Məsələn, A B.-dan az idi. Gücləndirmə başlayır və 30 dövründən sonra bir jel işlədirsiniz və A və B hər ikisi güclü bir siqnal var. Beləliklə, "A = B, nəzarət və təcrübə arasında heç bir fərq yoxdur" deyirsən. Yalnız 25 dövr etmisinizsə bu baş verməzdi. Nə demək istədiyimi görürsən?

Real vaxt PCR zamanı dövrü görə həmin dövrdə Amplifcon (gücləndirilmiş ip) nə qədər olduğunu görə bilərsiniz. Beləliklə, 30 dövrə keçirsəniz və nəticə əldə etsəniz, əvvəlki təkan dövründən deyə bilərsiniz: "Tamam, fərq realdır" və ya "Fərqi yoxdur".

Bu, həqiqətən proqramdan işləyir. Onların bir eşikləri var (siqnalı yalnız müəyyən bir ölçüdən yuxarı olduqda görə bilərsiniz, bunu öz ehtiyac təcrübəsinə əsasən yazıçı təyin edə bilər). Gördüyünüz kimi, nömrə 30 dövründən yuxarı bir platoda başlayır. Bu zaman şeyləri ayırd etmək mümkün olmayacaq, çünki hamısı eyni görünəcək! Bununla birlikdə, proqramla bütün dövrləri nəzərdən keçirə və dövrü ilə baş verənlərin icmalını əldə edə bilərsiniz.

Ümid edirəm kömək edir, daha ətraflı məlumat və ya izahat lazımdırsa, mənə bildirin.


cavab 2:

Xahiş etmədiniz, amma qeyd etmək istərdim ki, getdikcə populyarlaşan başqa bir kəmiyyət PCR sxemi var: rəqəmsal PCR.

Real vaxt PCR-in mənfi tərəfi standartlara qarşı heç bir şey etmədən həqiqətən kəmiyyət nəticələri əldə edə bilməyinizdir. Bunun əsas səbəbi, fərqli amplikonların fərqli gücləndirmə effektlərinə sahib olmasıdır ki, bu da öz növbəsində reaksiya şəraitinin dəyişməsi (məsələn, PCR plitəsi vasitəsi ilə temperaturun tənzimlənməsində qeyri-bərabərlik) və ya nümunə çirkləndiricilərindən təsirlənə bilər. Rəqəmsal PCR, PCR-ni ikili sistemə çevirərək bu problemləri aradan qaldırır: ya gücləndirmə görülür, ya da olmur.

Rəqəmsal PCR eyni giriş materialı ilə paralel olaraq bir çox PCR reaksiyasını yerinə yetirməkdən ibarətdir. Hiyləsi, bir çox reaksiya otağının şablon molekullarını almaması üçün nümunəni sulandırmaqdır. PCR aparılır və sonra müsbət otaqların sayı sayılır. Bunu Poisson paylanmasına əsaslanan tənliklərə daxil etsəniz, giriş molekullarının sayını qiymətləndirirsiniz. Saymağa əsaslandığından sayı standart bir əyridən asılı deyil. sadəcə kəmiyyətdir.

Bir sıra rəqəmsal PCR sistemləri reaksiya kameraları üçün quyular və ya damlalar istifadə edərək ticarəti edilmişdir. Həm də PCR kameralarının sayında fərqlənirlər; Damla sxemləri daha çox, daha yüksək rəqəmlərə vurdu. Dəqiqlik və dinamik diapazon həm damlaların sayından asılıdır - daha çox otaq varsa, ilkin konsentrasiyanızdan daha uzaq ola bilərsiniz.

Fərqli sxemlər müxtəlif avadanlıq xərcləri və sadə bir iş axını təklif edir. Məsələn, Fluidigm cihazı tam inteqrasiya olunmuşdur, lakin mənim fikrimcə, nümunə üçün 1000-dən az otaq təklif olunur, BioRad sistemində ayrıca emulsiya, gücləndirmə və sayma mərhələləri mövcuddur (iki xüsusi cihazla; termosikl standart bir termosikl işlədir) on minlərlə palataya malikdir.